Onderzoek

De afgelopen 4 jaar ben ik bezig geweest met een promotietraject aan de Universiteit Utrecht, in de groep Plant-Microbe Interactions. Gedurende deze tijd heb ik onderzoek gedaan aan infectie van de Zandraket met valse meeldauw. De focus was op eiwitten die worden uitgescheiden door de ziekteverwekker gedurende infectie, maar waarvan we geen idee hebben wat ze doen.

Onderzoek

Download mijn Thesis

Onderzoek

Comparative and functional analysis of secreted proteins of the oomycete Hyaloperonospora arabidopsidis

Samenvatting

Het in mijn proefschrift beschreven onderzoek gaat over Hyaloperonospora arabidopsidis, de valse meeldauw van de Zandraket (Arabidopsis thaliana). Deze ziekteverwekker behoort tot de familie van de oomyceten, en is een obligate biotroof, wat betekent dat het levende plantencellen nodig heeft gedurende zijn gehele levenscyclus. Verwante valse meeldauwsoorten berokkenen ernstige schade aan gewassen zoals druiven, zonnebloem en spinazie. Daarnaast beginnen de verwante en zeer destructieve ziekteverwekkers van het geslacht Phytophthora hun levenscyclus op dezelfde wijze, alleen doden zijn hun gastheercellen in een later stadium van de infectie. Een beter begrip van de valse meeldauwinfectie van de Zandraket kan daarom bijdragen aan de kennis over de mechanismen die plant-infecterende oomyceten hanteren. Deze kennis kan op zijn beurt weer leiden tot nieuwe ideeën om gewassen resistent te maken tegen deze ziektes.

Gewassen worden constant blootgesteld aan ziekteverwekkers, en dit leidt wereldwijd tot oogstverliezen van meer dan 10% per jaar. Plantenziekten worden meestal bestreden door het spuiten van chemicaliën, maar veel ziekteverwekkers hebben resistentie ontwikkeld tegen deze middelen. Daarnaast wordt het gebruik van deze middelen ontmoedigd, omdat ze vaak schadelijk zijn voor het milieu. Een efficiëntere en duurzamere methode om plantenziekten te bestrijden is door het immuunsysteem van de plant optimaal te benutten, en zo infectie te voorkomen. Hiervoor is gedetailleerde kennis van het infectieproces vereist. Om een plant te kunnen infecteren moet de ziekteverwekker zichzelf toegang tot de plant verschaffen, de permanent aanwezige afweermechanismen aanpakken, voorkomen dat de plant de ziekteverwekker herkent en daardoor zijn afweer lokaal verder opschroeft, en zichzelf van voedingsstoffen kunnen voorzien. Elk van deze stappen behoeft zijn eigen factoren. Sommige eiwitten die worden uitgescheiden door ziekteverwekkers, zoals celwandafbrekende enzymen die nodig zijn om toegang te verschaffen tot de plant, zijn reeds goed bestudeerd, en hun functie en activiteit zijn duidelijk. Echter, van vele andere eiwitten die ziekteverwekkers uitscheiden is de rol of functie (nog) niet bekend.

Het genoom van H. arabidopsidis is gebruikt om uitgescheiden eiwitten op te sporen die wellicht betrokken zijn bij het infectieproces. De eerste groep van uitgescheiden eiwitten die werd gekozen om nader te bestuderen zijn de Hexose 6-Fosfaat-Epimerase-achtige eiwitten. De reden hiervoor is dat deze groep van eiwitten zowel in valse meeldauw als in Phytophthora aanwezig is, en dat ze tot expressie worden gebracht door H. arabidopsidis tijdens de infectie (Hoofdstuk 2). Deze groep van uitgescheiden eiwitten wordt, naast in oomyceten, ook in planten gevonden. Experimenten lieten zien dat deze eiwitten niet dezelfde activiteit hebben als die van een goed gekarakteriseerde ortholoog uit gist. Dit doet vermoeden dat deze eiwitten een nieuwe functie hebben geëvolueerd, die wellicht bijdraagt aan de infectie.

Een tweede groep van eiwitten die gecodeerd zijn in het genoom van H. arabidopsidis, zijn de Necrose-en-Ethyleen-inducerend Peptide 1 (Nep1)-achtige eiwitten. Zoals de naam suggereert zijn leden van deze groep van eiwitten met name bekend om hun vermogen plantencellen te doden (necrose). H. arabidopsidis is echter een obligate biotroof en heeft levende plantencellen nodig voor zijn eigen groei en reproductie. Hoofdstuk 3 laat zien dat H. arabidopsidis 10 verschillende Nep1-achtige eiwitten bezit, de meeste hiervan tot expressie brengt gedurende infectie, maar dat geen enkele hiervan dodelijk is voor plantencellen. Een van deze eiwitten is nader bestudeerd, omdat deze sterke gelijkenis vertoont met een Nep1-achtige eiwit (PsojNIP) dat wèl in staat is om plantencellen te doden. Hoewel deze eiwitten sterk op elkaar lijken, blijkt dat een gedeelte van het eiwit dat zich aan buitenzijde bevindt aan is te wijzen dat verantwoordelijk is voor het verschil in activiteit.

De familie van Nep1-achtige eiwitten is wijdverbreid onder micro-organismen; ze worden niet enkel gevonden in plant-infecterende oomyceten, maar ook in schimmels en bacteriën. Om een beter begrip te krijgen van deze groep eiwitten zijn (in Hoofdstuk 4) veel databanken afgezocht naar gerelateerde Nep1-achtige eiwitten van veel verschillende organismen. Meer dan 500 gerelateerde sequenties zijn gevonden, welke konden worden onderverdeeld in drie duidelijke types. Binnen de oomyceten is een type 1 subgroep gevonden, die gekenmerkt wordt door het ontbreken van een kation-bindende holte die noodzakelijk is voor inductie van necrose. Van de 10 Nep1-achtige eiwitten die gevonden zijn in H. arabidopsidis missen 9 deze holte, wat er op wijst dat dit de oorzaak is van hun gebrek om plantcellen te kunnen doden. Dit type Nep1-achtige eiwit dat de kation-bindende holte mist wordt ook aangetroffen in Phytophthora, wat er op duidt dat deze eiwitten een nieuwe functie gekregen hebben die voordelig is voor dit soort ziekteverwekkers. Twee eerder beschreven types Nep1-achtige eiwitten verschillen op meerdere vlakken, zowel in sequentie als in hun activiteit in de plant. Deze kennis kan mogelijk helpen om het exacte mechanisme te ontrafelen hoe deze eiwitten plantcellen doden.

De Nep1-achtige eiwitten van H. arabidopsidis zijn niet in staat om plantencellen te doden, maar komen wel tot expressie tijdens infectie van de plant, wat er op duidt dat ze een alternatieve functie hebben. In een poging om deze nieuwe functie te achterhalen (Hoofdstuk 5) zijn deze eiwitten tot expressie gebracht in Arabidopsis. Dit resulteerde in sterk verminderde groei, wat er op kan duiden dat het immuunsysteem is geactiveerd. Genexpressie-analyse van Arabidopsis die Nep1-achtig-eiwit tot expressie brengt na inductie met estradiol laat zien dat afweerreacties inderdaad sterk worden geactiveerd. Door expressie van kleine fragmenten van het Nep1-achtig eiwit werd aangetoond dat een klein, sterk geconserveerd fragment herkend wordt door Arabidopsis. Tabaksplanten herkenden dit eiwitfragment niet, wat er op kan wijzen dat Arabidopsis wellicht uniek is in de herkenning van Nep1-achtige eiwitten. Deze vondst is erg interessant, aangezien de mogelijke receptor die zorgt voor de herkenning van deze eiwitten kan worden toegepast om gewassen resistent te maken tegen de (vele) ziekteverwekkers die deze groep van eiwitten produceren.

In de discussie (Hoofdstuk 6) wordt de mogelijke bron en de functie van zowel de Hexose 6-Fosfaat-Epimerase-achtige eiwitten als de Nep1-achtige eiwitten besproken. De Nep1-achtige eiwitten die gevonden worden in oomyceten lijken afkomstig te zijn van schimmels, terwijl de Hexose 6-Fosfaat-Epimerase-achtige eiwitten lijken te zijn ontstaan uit een huishoudgen. Er wordt een model voorgesteld voor de verschillende types van Nep1-achtige eiwitten, en de specifieke herkenning van deze eiwitten in Arabidopsis wordt verder besproken.